小伙伴們在給貼壁細胞傳代的時候有沒有遇到細胞消化不下來的情況呢？有時候等了10分鐘甚至20分鐘細胞仍巋然不動，繼續(xù)等待怕消化過度，暴力吹下又怕對細胞造成機械損傷，可謂進退兩難。

小尚為大家總結(jié)了細胞難消化的原因，以及對應(yīng)的處理方式：

（本文僅針對胰蛋白酶，若您使用其他類型的細胞解離試劑，可以在評論區(qū)留言）

1. 細胞貼壁緊

不同種類的細胞貼壁的松緊程度是不一樣的，比如293系列細胞貼壁很松，是晃一晃就可能掉下來的程度。而MCF10A細胞卻貼壁很緊，可能需要消化5-10min甚至更久才能脫落。在培養(yǎng)一株細胞之前，可以問問有經(jīng)驗的師哥師姐或者上網(wǎng)查資料確認這株細胞大概消化多久，做到知己知彼百戰(zhàn)百勝。

解決方案：若您培養(yǎng)的細胞貼壁較緊，可以增加消化時間或胰酶的濃度；加入足量的胰酶至沒過細胞；37℃消化；使用含有EDTA的胰酶。

小技巧：

在消化貼壁較緊的細胞有個小技巧，就是消化到細胞要脫落的時候先不終止，先吸胰酶輕輕吹下細胞，大部分細胞脫落后再加終止液。貼壁太強的細胞，先加終止有時候會很快貼壁回去導(dǎo)致消化其實細胞已經(jīng)要脫落了，但一加終止液就貼回去的情況。

2. 有殘留血清

血清中的某些蛋白質(zhì)（如α1-抗胰蛋白酶，α2-巨球蛋白）對蛋白酶有強烈的抑制作用。如果PBS清洗不徹*，胰酶將不能發(fā)揮作用。

解決方案：若在消化途中發(fā)現(xiàn)因潤洗不徹*而無法消化下來，吸去培養(yǎng)器皿中的胰酶（如果已有部分細胞脫落，將已脫落細胞轉(zhuǎn)移至離心管），向培養(yǎng)器皿中加入足量PBS重新潤洗30s，棄去PBS再加入新的胰酶重新消化。

3. 胰酶量過少/濃度低/消化溫度低

有的小伙伴習(xí)慣用胰酶潤洗細胞后去掉大部分胰酶，用剩余的胰酶繼續(xù)消化，這對于貼壁松的細胞是可以的，但該方法并不適用于貼壁緊的細胞。胰酶量太少無法將貼壁緊的細胞消化徹*。

胰酶的最適溫度是37℃，有一種常用策略是室溫消化，當(dāng)溫度低于37℃時胰酶活性低，室溫環(huán)境消化還可以放在顯微鏡下邊看邊消化，更容易把握消化進度。但仍然需要注意這適用于貼壁較松且比較脆弱的細胞，對于貼壁緊的細胞室溫下是很難消化下來的，甚至可能因消化時間過長對細胞產(chǎn)生傷害。

常見的胰酶濃度有0.125%，0.25%和0.5%。常規(guī)細胞系多用0.25%胰酶，而對胰酶敏感的較脆弱的細胞可使用0.125%胰酶消化。應(yīng)根據(jù)細胞的貼壁特性和胰酶耐受程度，使用不同濃度的胰酶。

解決方案：根據(jù)細胞貼壁特性選擇合適的胰酶使用量、濃度和消化溫度。

4. 胰酶失活

胰酶開封久了活性會降低甚至徹*失活，所以小伙伴們可以根據(jù)需要將開封的胰酶分裝到離心管中，將暫時不用的部分放在-20℃冰箱冷凍，放在2-8℃冷藏的胰酶也要盡早使用完畢哦。

解決方案：若發(fā)現(xiàn)胰酶開封太久，建議使用新的胰酶進行消化。

5. 胰酶品牌差異

胰酶通常來自?；蜇i的胰腺，不同廠家的提取加工工藝不同，所生產(chǎn)的胰酶消化時間差別較大。

解決方案：從不同廠家獲取胰酶試用裝，找到*適合自己細胞的胰酶品牌。

6. 細胞密度過大或長時間不傳代

細胞密度過大，造成細胞擁擠或者堆疊時細胞將變得更難消化。另外，細胞長時間培養(yǎng)不傳代也有可能使細胞貼壁變緊。

解決方案：若出現(xiàn)上述情況，可增加胰酶的用量，并適當(dāng)延長消化時間，直到細胞能夠脫落。