H22細(xì)胞小鼠肝癌細(xì)胞傳代方法

H22細(xì)胞小鼠肝癌細(xì)胞傳代方法

---尚恩生物 186278592O3---

細(xì)胞培養(yǎng)操作

換液周期：2-3天

培養(yǎng)基體積：T25瓶10-12ml；10cm皿12-15ml

傳代比例：1:2-1:4（具體情況視細(xì)胞生長速度及密度決定）

傳代方法：

1.盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基；

2.加3-4ml 常溫PBS輕輕潤洗細(xì)胞10-20s，吸走潤洗的PBS；

3.T25瓶加1ml左右胰M，輕輕晃動培養(yǎng)瓶以使胰M鋪勻瓶底細(xì)胞層；

4.將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；

5.消化到細(xì)胞間隙變大，但未*脫落時加2-3ml*培養(yǎng)基終止胰M消化；

6.混勻細(xì)胞，900rpm離心3-5min，棄上清；

7.加新的*培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里；

8.補(bǔ)足*培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；

注意事項 不同品牌胰M消化時間差別較大，注意嚴(yán)格控制消化時間

消化傳代細(xì)胞時吹打細(xì)胞注意盡量輕柔，不要產(chǎn)生過多氣泡以免影響細(xì)胞狀態(tài)。

細(xì)胞凍存操作

凍存液配方：92%FBS+8%DMSO(新手建議)或92%*培養(yǎng)基+8%DMSO(高手建議);

凍存規(guī)格：200-300萬/ml，1ml每管

凍存方法：

1.消化并離心獲得細(xì)胞沉淀后，加配置好的凍存液輕輕重懸細(xì)胞；

2.將細(xì)胞懸液盡快移入已經(jīng)做好標(biāo)記的凍存管；

3.將凍存管轉(zhuǎn)入程序凍存盒，放入-80度冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)入液氮保存；沒有程序凍存盒的實驗室，加入細(xì)胞后可以將凍存管放在泡沫盒中4度靜置5-10min，再-20度靜置2h后轉(zhuǎn)入-80度過夜，第二天轉(zhuǎn)入液氮保存

注意事項 凍存細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮后及時復(fù)蘇一管檢查細(xì)胞凍存活性，若有異常，及時調(diào)整實驗方案

收貨處理方式（T25瓶/凍存管）

【T25】

①快遞保存溫度：室溫

②初步平衡：T25瓶表面消毒后，放37度培養(yǎng)箱平衡復(fù)溫2h以上

③處理方式：吸走大部分培養(yǎng)基，留10-12ml培養(yǎng)基，拍照并觀察細(xì)胞。密度80%以上即可吸走培養(yǎng)基消化傳代，若密度低于80%可以留10-12 ml繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上

④接種方式：T25傳代第①次建議1:2傳代，即瓶T25傳成兩瓶

⑤注意事項：若細(xì)胞出現(xiàn)漂浮，T25瓶不開封，放至37度培養(yǎng)箱過夜，若細(xì)胞貼壁即說明活性正常，按正常操作消化傳代即可；若未貼壁，收集細(xì)胞培養(yǎng)基離心后，將細(xì)胞重懸接種到新的培養(yǎng)瓶中，同時原瓶還貼壁的細(xì)胞加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)
發(fā)貨T25瓶裝滿大約有75ml培養(yǎng)基，可以收集起來，1500rpm離心5min后，取上清4度保存，用于培養(yǎng)細(xì)胞，以平穩(wěn)過渡到客戶自己的培養(yǎng)基

【凍存管】

①快遞保存溫度：液氮長期保存或-80度3天以內(nèi)

②初步平衡：無須平衡，直接放入-80冰箱或者液氮罐保存

③處理方式：37度水浴搖晃盡快融化細(xì)胞，直接在凍存管內(nèi)將細(xì)胞離心。離心轉(zhuǎn)速以離心力150g(約900rpm)左右，1min為宜，棄上清，沉淀用新鮮培養(yǎng)基重懸后接種到10cm培養(yǎng)皿，顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照，24h后換液一次

④接種方式：一管細(xì)胞建議接種到10cm培養(yǎng)皿或者T25瓶

⑤注意事項：收貨時若發(fā)現(xiàn)干冰化完，檢查凍存管是否融化，若已融化需直接離心細(xì)胞接種觀察，若未融化可以將細(xì)胞按正常步驟保存，以上情況及時反饋
干冰發(fā)貨的細(xì)胞只能在-80保存3天左右，長時間保存會出現(xiàn)活性下降。干冰發(fā)貨均為兩支，客戶先復(fù)蘇一支，若復(fù)蘇失敗及時聯(lián)系我方并在我方指導(dǎo)下復(fù)蘇第二支。若客戶同時復(fù)蘇兩支均狀態(tài)不佳，我方將不提供免費(fèi)售后服務(wù)

特殊情況：

1.若培養(yǎng)瓶或者凍存管出現(xiàn)破碎或漏液情況，及時拍照聯(lián)系銷售反饋，按指導(dǎo)進(jìn)行進(jìn)一步處理。若只是外包裝破損一般不影響培養(yǎng)瓶和凍存管，請放心使用。

2.若無法觀察到細(xì)胞，建議收集細(xì)胞培養(yǎng)基，1200rpm離心5min，觀察細(xì)胞沉淀量，并用少量培養(yǎng)基重懸沉淀后，取部分懸液放到計數(shù)板或者載玻片上觀察細(xì)胞。

3.部分細(xì)胞增殖較快，發(fā)貨細(xì)胞量較多時，培養(yǎng)基可能出現(xiàn)顏色變黃現(xiàn)象。繼續(xù)培養(yǎng)使用此類培養(yǎng)基時，需要及時觀察培養(yǎng)基顏色變化，縮短培養(yǎng)基換液周期，并每瓶多加2-3ml培養(yǎng)基。

4.收貨當(dāng)天不處理細(xì)胞時，T25瓶可以消毒拆封口膜后不擰開瓶蓋放37度培養(yǎng)箱靜置過夜，但不建議超過24h；凍存管可以直接放液氮長期保存或-80度3天以內(nèi)，必須一周內(nèi)復(fù)蘇一只培養(yǎng)檢查，否則將超過一周售后期。

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